1 範圍

本标準規定了肺結核診斷依據、診斷原則、診斷和鑒别診斷。

本标準适用于全國各級各類醫療衛生(shēng)機構及其醫務人員(yuán)對肺結核的診斷。

2 術語和定義

下(xià)列術語和定義适用于本文件。

2.1

肺結核 pulmonary tuberculosis

發生(shēng)在肺組織、氣管、支氣管和胸膜的結核病變。肺結核病原學參見附錄A。

2.2

結核分(fēn)枝杆菌 mycobacterium tuberculosis

簡稱結核杆菌，是人類結核病的病原菌。結核分(fēn)枝杆菌的形态爲細長直或稍彎曲、兩端圓鈍的杆菌，長1μm～4μm，寬0.3μm～0.6μm。

3 診斷依據

3.1 流行病學史

有肺結核患者接觸史。

3.2 臨床表現

3.2.1 症狀

咳嗽、咳痰≥2周，或痰中(zhōng)帶血或咯血爲肺結核可疑症狀。

肺結核多數起病緩慢(màn)，部分(fēn)患者可無明顯症狀，僅在胸部影像學檢查時發現。随着病變進展，可出現咳嗽、咳痰、痰中(zhōng)帶血或咯血等，部分(fēn)患者可有反複發作的上呼吸道感染症狀。肺結核還可出現全身症狀，如盜汗、疲乏、間斷或持續午後低熱、食欲不振、體(tǐ)重減輕等，女性患者可伴有月經失調或閉經。少數患者起病急驟， 有中(zhōng)、高度發熱，部分(fēn)伴有不同程度的呼吸困難。

病變發生(shēng)在胸膜者可有刺激性咳嗽、胸痛和呼吸困難等症狀。

病變發生(shēng)在氣管、支氣管者多有刺激性咳嗽，持續時間較長，支氣管淋巴瘘形成并破入支氣管内或支氣管狹窄者，可出現喘鳴或呼吸困難。

少數患者可伴有結核性超敏感症候群，包括：結節性紅斑、疱疹性結膜炎/角膜炎等。

兒童肺結核還可表現發育遲緩，兒童原發性肺結核可因氣管或支氣管旁淋巴結腫大(dà)壓迫氣管或支氣管，或發生(shēng)淋巴結-支氣管瘘，常出現喘息症狀。

當合并有肺外(wài)結核病時，可出現相應累及髒器的症狀。

3.2.2 體(tǐ)征

早期肺部體(tǐ)征不明顯，當病變累及範圍較大(dà)時，局部叩診呈濁音，聽(tīng)診可聞及管狀呼吸音，合并感染或合并支氣管擴張時，可聞及濕性啰音。

病變累及氣管、支氣管，引起局部狹窄時，聽(tīng)診可聞及固定、 局限性的哮鳴音，當引起肺不張時，可表現氣管向患側移位，患側胸廓塌陷、肋間隙變窄、叩診爲濁音或實音、聽(tīng)診呼吸音減弱或消失。

病變累及胸膜時，早期于患側可聞及胸膜摩擦音，随着胸腔積液的增加，患側胸廓飽滿，肋間隙增寬，氣管向健側移位，叩診呈濁音至實音，聽(tīng)診呼吸音減弱至消失。當積液減少或消失後，可出現胸膜增厚、粘連， 氣管向患側移位，患側胸廓可塌陷，肋間隙變窄、呼吸運動受限，叩診爲濁音，聽(tīng)診呼吸音減弱。

原發性肺結核可伴有淺表淋巴結腫大(dà)，血行播散性肺結核可伴肝脾腫大(dà)、眼底脈絡膜結節，兒童患者可伴皮膚粟粒疹。

3.3 胸部影像學檢查

3.3.1 原發性肺結核

原發性肺結核主要表現爲肺内原發病竈及胸内淋巴結腫大(dà)，或單純胸内淋巴結腫大(dà)。兒童原發性肺結核也可表現爲空洞、幹酪性肺炎以及由支氣管淋巴瘘導緻的支氣管結核。

3.3.2 血行播散性肺結核

急性血行播散性肺結核表現爲兩肺均勻分(fēn)布的大(dà)小(xiǎo)、密度一(yī)緻的粟粒陰影;亞急性或慢(màn)性血行播散性肺結核的彌漫病竈，多分(fēn)布于兩肺的上中(zhōng)部，大(dà)小(xiǎo)不一(yī)，密度不等，可有融合。兒童急性血行播散性肺結核有時僅表現爲磨玻璃樣影，嬰幼兒粟粒病竈周圍滲出明顯，邊緣模糊，易于融合。

3.3.3 繼發性肺結核

繼發性肺結核胸部影像表現多樣。輕者主要表現爲斑片、結節及索條影，或表現爲結核瘤或孤立空洞; 重者可表現爲大(dà)葉性浸潤、幹酪性肺炎、多發空洞形成和支氣管播散等; 反複遷延進展者可出現肺損毀，損毀肺組織體(tǐ)積縮小(xiǎo)，其内多發纖維厚壁空洞、繼發性支氣管擴張，或伴有多發鈣化等，鄰近肺門和縱隔結構牽拉移位，胸廓塌陷，胸膜增厚粘連， 其他肺組織出現代償性肺氣腫和新舊(jiù)不一(yī)的支氣管播散病竈等。

3.3.4 氣管、支氣管結核

氣管及支氣管結核主要表現爲氣管或支氣管壁不規則增厚、管腔狹窄或阻塞，狹窄支氣管遠端肺組織可出現繼發性不張或實變、支氣管擴張及其他部位支氣管播散病竈等。

3.3.5 結核性胸膜炎

結核性胸膜炎分(fēn)爲幹性胸膜炎和滲出性胸膜炎。幹性胸膜炎爲胸膜的早期炎性反應，通常無明顯的影像表現;滲出性胸膜炎主要表現爲胸腔積液，且胸腔積液可表現爲少量或中(zhōng)大(dà)量的遊離(lí)積液，或存在于胸腔任何部位的局限積液，吸收緩慢(màn)者常合并胸膜增厚粘連，也可演變爲胸膜結核瘤及膿胸等。

3.4 實驗室檢查

3.4.1 細菌學檢查

檢查方法見附錄 B。檢查結果如下(xià)：

a) 塗片顯微鏡檢查陽性;

b) 分(fēn)枝杆菌培養陽性，菌種鑒定爲結核分(fēn)枝杆菌複合群。

3.4.2 分(fēn)子生(shēng)物(wù)學檢查

結核分(fēn)枝杆菌核酸檢測陽性。

3.4.3 結核病病理學檢查

結核病組織病理改變見附錄 C。

3.4.4 免疫學檢查

3.4.4.1 結核菌素皮膚試驗，中(zhōng)度陽性或強陽性(見附錄 D)。

3.4.4.2 γ-幹擾素釋放(fàng)試驗陽性。

3.4.4.3 結核分(fēn)枝杆菌抗體(tǐ)陽性。

3.5 支氣管鏡檢查

支氣管鏡檢查可直接觀察氣管和支氣管病變，也可以抽吸分(fēn)泌物(wù)、刷檢及活檢。

4 診斷原則

肺結核的診斷是以病原學(包括細菌學、分(fēn)子生(shēng)物(wù)學)檢查爲主，結合流行病史、臨床表現、胸部影像、 相關的輔助檢查及鑒别診斷等，進行綜合分(fēn)析做出診斷。以病原學、病理學結果作爲确診依據。

兒童肺結核的診斷，除痰液病原學檢查外(wài)，還要重視胃液病原學檢查。

5 診斷

5.1 疑似病例

凡符合下(xià)列項目之一(yī)者：

a) 具備 3.3 中(zhōng)任一(yī)條者;

b) 5 歲以下(xià)兒童：具備 3.2 同時具備 3.1， 3.4.4.1， 3.4.4.2 任一(yī)條。

5.2 臨床診斷病例

經鑒别診斷排除其他肺部疾病，同時符合下(xià)列項目之一(yī)者：

a) 具備 3.3 中(zhōng)任一(yī)條及 3.2 者;

b) 具備 3.3 中(zhōng)任一(yī)條及 3.4.4.1 者;

c) 具備 3.3 中(zhōng)任一(yī)條及 3.4.4.2 者;

d) 具備 3.3 中(zhōng)任一(yī)條及 3.4.4.3 者;

e) 具備 3.3 中(zhōng)任一(yī)條及肺外(wài)組織病理檢查證實爲結核病變者;

f) 具備 3.3.4 及 3.5 者可診斷爲氣管、支氣管結核;

g) 具備 3.3.5 和胸水爲滲出液、腺苷脫氨酶升高，同時具備 3.4.4.1， 3.4.4.2， 3.4.4.3 任一(yī)條者，可診斷爲結核性胸膜炎;

h) 兒童肺結核臨床診斷病例應同時具備以下(xià) 2 條：

1) 具備 3.3 中(zhōng)任一(yī)條及 3.2 者;

2) 具備 3.4.4.1， 3.4.4.2 任一(yī)條者。

5.3 确診病例

5.3.1 痰塗片陽性肺結核診斷

凡符合下(xià)列項目之一(yī)者：

a) 2 份痰标本塗片抗酸杆菌檢查符合 3.4.1.a 者;

b) 1 份痰标本塗片抗酸杆菌檢查符合 3.4.1.a，同時具備 3.3 中(zhōng)任一(yī)條者;

c) 1 份痰标本塗片抗酸杆菌檢查符合 3.4.1.a，并且 1 份痰标本分(fēn)枝杆菌培養符合 3.4.1.b 者。

5.3.2 僅分(fēn)枝杆菌分(fēn)離(lí)培養陽性肺結核診斷

符合3.3中(zhōng)任一(yī)條，至少2份痰标本塗片陰性并且分(fēn)枝杆菌培養符合3.4.1.b者。

5.3.3 分(fēn)子生(shēng)物(wù)學檢查陽性肺結核診斷

符合3.3中(zhōng)任一(yī)條及3.4.2者。

5.3.4 肺組織病理學檢查陽性肺結核診斷

符合3.4.3者。

5.3.5 氣管、支氣管結核診斷

凡符合下(xià)列項目之一(yī)者：

a) 具備 3.5 及氣管、支氣管病理學檢查符合 3.4.3 者;

b) 具備 3.5 及氣管、支氣管分(fēn)泌物(wù)病原學檢查，符合 3.4.1.a 或 3.4.1.b 或 3.4.2 者。

5.3.6 結核性胸膜炎診斷

凡符合下(xià)列項目之一(yī)者：

a) 具備 3.3 及胸水或胸膜病理學檢查符合 3.4.3 者;

b) 具備 3.3 及胸水病原學檢查， 符合 3.4.1.a 或 3.4.1.b 或 3.4.2 者。

6 鑒别診斷

肺結核的症狀、體(tǐ)征和影像學表現同許多胸部疾病相似，在診斷肺結核時，應注意與其他疾病相鑒别(參見E.1) ， 包括與非結核分(fēn)枝杆菌肺病鑒别(參見E.2) 。 經鑒定符合非結核分(fēn)枝杆菌者按非結核分(fēn)枝杆菌肺病處理。

AA

附 錄 A

(資(zī)料性附錄)

肺結核病原學

A.1 結核分(fēn)枝杆菌的形态與染色特性

結核分(fēn)枝杆菌細長略彎曲，聚集呈分(fēn)枝狀排列增殖。因其細胞壁含有大(dà)量脂質，不易着色，經萋-尼氏抗酸染色呈紅色，無菌毛和鞭毛，不形成芽孢(胞)，現證明有莢膜。 單在，成雙,間或成叢排列。

在人工(gōng)培養基上，由于菌型、菌株和環境條件不同，可出現多種形态，如近似球形、棒狀或絲狀。在電(diàn)鏡下(xià)觀察其具有複雜(zá)結構：由微莢膜、細胞外(wài)殼的三層結構、胞漿膜、胞漿、間體(tǐ)、核糖體(tǐ)及中(zhōng)間核質構成。

典型的結核分(fēn)枝杆菌的形态爲細長稍彎曲或直的，兩端圓鈍的杆菌，長1 μm～4 μm，寬0.3μm～0.6 μm，單個散在，有時呈X、 Y形或條索狀。痰标本塗片經過抗酸染色後在100倍的生(shēng)物(wù)顯微鏡下(xià)可以看到。

結核分(fēn)枝杆菌在體(tǐ)内外(wài)經青黴素、環絲氨酸或溶菌酶誘導， 可影響細胞壁中(zhōng)肽聚糖的合成，異煙肼影響分(fēn)枝菌酸的合成，巨噬細胞吞噬結核分(fēn)枝杆菌後溶菌酶的作用可破壞肽聚糖，均可導緻其變爲L型，呈顆粒狀或絲狀。

A.2 結核分(fēn)枝杆菌的培養特性

結核分(fēn)枝杆菌爲專性需氧菌，營養要求高，最适pH以6.5～6.8爲宜，生(shēng)長緩慢(màn)， 初次分(fēn)離(lí)需要營養豐富的培養基。常用的有羅氏固體(tǐ)培養基，内含蛋黃、甘油、馬鈴薯、無機鹽和孔雀綠等。孔雀綠可抑制雜(zá)菌生(shēng)長，便于分(fēn)離(lí)和長期培養。蛋黃含脂質生(shēng)長因子，能刺激生(shēng)長。根據接種菌多少，一(yī)般2周～4周可見菌落生(shēng)長。在固體(tǐ)培養基上菌落呈灰黃白(bái)色，幹燥顆粒狀，顯著隆起，表面粗糙皺縮、菜花狀的菌落。在液體(tǐ)培養基内，于液面形成粗紋皺膜，培養基保持透明。若加入吐溫80于培養基中(zhōng)， 可使結核杆菌呈分(fēn)散均勻生(shēng)長， 一(yī)般1周～2周即可生(shēng)長。臨床标本檢查液體(tǐ)培養比固體(tǐ)培養的陽性率高數倍。菌

體(tǐ)爲細長略彎的杆菌，經抗酸染色染成紅色。對幹燥的抵抗力特别強，對酸堿有較強的抵抗力，易産生(shēng)耐藥性變異及L型細菌。

A.3 結核分(fēn)枝杆菌的生(shēng)化特性

結核杆菌不發酵糖類，能産生(shēng)過氧化氫酶。對人緻病的結核分(fēn)枝杆菌現一(yī)般認爲有人型、牛型、非洲型。人型與牛型菌形态相似，對豚鼠皆有較強緻病力，但人型菌對家兔緻病力遠較牛型菌爲弱。人型結核杆菌能合成煙酸，還原硝酸鹽，耐受噻吩—2—羧酸酰肼，牛型結核杆菌都不具備上述特性。人型和牛型的毒株，中(zhōng)性紅試驗均陽性，無毒株，則中(zhōng)性紅陰性且失去(qù)索狀生(shēng)長現象。熱觸酶試驗對區别結核分(fēn)枝杆菌與非結核分(fēn)枝杆菌有重要意義。結核分(fēn)枝杆菌大(dà)多數觸酶試驗陽性，而熱觸酶試驗陰性，非結核分(fēn)枝杆菌則大(dà)多數兩種試驗均陽性。熱觸酶試驗檢查方法是将濃的細菌懸液置68℃水浴加溫20 min，然後再加H2O2。 觀察是否産生(shēng)氣泡，有氣泡者爲陽性。牛型結核分(fēn)枝杆菌可經飲用未消毒的帶菌牛乳引起腸道結核感染。顯微鏡下(xià)均爲抗酸杆菌，細長稍彎，有時見人字型、 Y型分(fēn)枝，培養生(shēng)長經生(shēng)化試驗可以鑒别菌型。

A.4 結核分(fēn)枝杆菌的抵抗力

結核分(fēn)枝杆菌對酸、堿、自然環境和幹燥有抵抗力，但對濕熱、酒精和紫外(wài)線敏感，對抗結核藥物(wù)易産生(shēng)耐藥性。結核分(fēn)枝杆菌細胞壁中(zhōng)含有脂質，故對乙醇敏感。 75%酒精作用5 min～30 min死亡，液體(tǐ)中(zhōng)加熱62℃～63℃， 30 min死亡。結核分(fēn)枝杆菌對紫外(wài)線敏感，直接日光照射2 h～7 h可被殺死。

紫外(wài)線可用于結核患者衣服、書(shū)籍等的消毒。

結核分(fēn)枝杆菌在幹燥痰内可存活6個月～8個月， 對抗結核藥物(wù)易産生(shēng)耐藥性。 結核分(fēn)枝杆菌的抵抗力與環境中(zhōng)有機物(wù)的存在有密切關系，如痰液可增強結核分(fēn)枝杆菌的抵抗力。因大(dà)多數消毒劑可使痰中(zhōng)的蛋白(bái)質凝固，包在細菌周圍，使細菌不易被殺死。 5%石炭酸在無痰時30 min可殺死結核分(fēn)枝杆菌，有痰時需要24h; 5%來蘇兒無痰時5 min殺死結核分(fēn)枝杆菌，有痰時需要1 h～2 h。

結核分(fēn)枝杆菌對酸(3% HCl或6% H2SO4) 或堿(4% NaOH) 有抵抗力， 15 min不受影響。可在分(fēn)離(lí)培養時用于處理有雜(zá)菌污染的标本和消化标本中(zhōng)的黏稠物(wù)質。結核分(fēn)枝杆菌對1： 13 000孔雀綠有抵抗力，加在培養基中(zhōng)可抑制雜(zá)菌生(shēng)長。結核分(fēn)枝杆菌對鏈黴素、異煙肼、利福平、環絲氨酸、乙胺丁醇、卡那黴素、對氨基水楊酸等敏感，但長期用藥容易出現耐藥性。

A.5 結核分(fēn)枝杆菌的變異性

結核分(fēn)枝杆菌變異性包括：

a) 耐藥性變異：結核分(fēn)枝杆菌對抗結核藥物(wù)較易産生(shēng)耐藥性，造成耐藥菌株增多，給治療造成困難。

b) 毒力變異：将有毒的牛分(fēn)枝杆菌培養于含甘油、膽汁、 馬鈴薯的培養基中(zhōng)，經230次移種傳代，曆時13年而獲得了減毒活菌株，即卡介苗，目前廣泛用于人類結核病的預防。

A.6 結核分(fēn)枝杆菌的緻病性

結核分(fēn)枝杆菌不産生(shēng)内、外(wài)毒素。其緻病性可能與細菌在組織細胞内大(dà)量繁殖引起的炎症，菌體(tǐ)成分(fēn)和代謝物(wù)質的毒性以及機體(tǐ)對菌體(tǐ)成分(fēn)産生(shēng)的免疫損傷有關。緻病物(wù)質與莢膜、脂質和蛋白(bái)質有關。

A.6.1 莢膜

莢膜的主要成分(fēn)爲多糖，部分(fēn)脂質和蛋白(bái)質。其對結核分(fēn)枝杆菌的作用有：①莢膜能與吞噬細胞表面的補體(tǐ)受體(tǐ)3(CR3)結合，有助于結核分(fēn)枝杆菌在宿主細胞上的黏附與入侵;②莢膜中(zhōng)有多種酶可降解宿主組織中(zhōng)的大(dà)分(fēn)子物(wù)質，供入侵的結核分(fēn)枝杆菌繁殖所需的營養;③莢膜能防止宿主的有害物(wù)質進入結核分(fēn)枝杆菌，甚至如小(xiǎo)分(fēn)子NaOH也不易進入。故結核标本用4% NaOH消化時，一(yī)般細菌很快殺死，但結核分(fēn)枝杆菌可耐受數十分(fēn)鍾。結核分(fēn)枝杆菌入侵後莢膜還可抑制吞噬體(tǐ)與溶酶體(tǐ)的融合。

A.6.2 脂質

據實驗研究，細菌毒力可能與其所含複雜(zá)的脂質成分(fēn)有關， 特别是糖脂更爲重要。①索狀因子： 是分(fēn)枝菌酸和海藻糖結合的一(yī)種糖脂。能使細菌在液體(tǐ)培養基中(zhōng)呈蜿蜒索狀排列。此因子與結核分(fēn)枝杆菌毒力密切相關。它能破壞細胞線粒體(tǐ)膜，影響細胞呼吸，抑制白(bái)細胞遊走和引起慢(màn)性肉芽腫。若将其從細菌中(zhōng)提出，則細菌喪失毒力。②磷脂：能促使單核細胞增生(shēng)，并使炎症竈中(zhōng)的巨噬細胞轉變爲類上皮細胞，從而形成結核結節。③硫酸腦苷脂(sulfatide)：可抑制吞噬細胞中(zhōng)吞噬體(tǐ)與溶酶體(tǐ)的結合，使結核分(fēn)枝杆菌能在吞噬細胞中(zhōng)長期存活。④蠟質D：是一(yī)種肽糖脂和分(fēn)枝菌酸的複合物(wù)，可從有毒株或卡介苗中(zhōng)用甲醇提出，具有佐劑作用，可激發機體(tǐ)産生(shēng)遲發型超敏反應。

A.6.3 蛋白(bái)質

有抗原性，和蠟質D結合後能使機體(tǐ)發生(shēng)超敏反應，引起組織壞死和全身中(zhōng)毒症狀，并在形成結核結節中(zhōng)發揮一(yī)定作用。

A.7 結核分(fēn)枝杆菌的免疫反應

結核分(fēn)枝杆菌是胞内感染菌，其免疫主要是以T細胞爲主的細胞免疫。T細胞不能直接和胞内菌作用，先與感染細胞反應，導緻細胞崩潰，釋放(fàng)出結核分(fēn)枝杆菌。機體(tǐ)對結核分(fēn)枝杆菌雖能産生(shēng)抗體(tǐ)，但抗體(tǐ)隻能與釋出的細菌接觸起輔助作用。

A.7.1 免疫反應

一(yī)直以來認爲在天然免疫中(zhōng)巨噬細胞是結核感染的主要的靶細胞，也是機體(tǐ)抗結核感染的最早起作用和最具有代表性的細胞群。但随着研究的深入，發現在結核感染的發展中(zhōng)有重要作用的其他細胞群，如中(zhōng)性粒細胞，是最早被征集到炎症部位，通過氧依賴的殺菌物(wù)質和胞外(wài)捕獲機制來殺病原微生(shēng)物(wù)。而且有研究者在感染實驗動物(wù)前，将中(zhōng)性粒細胞去(qù)除，結果分(fēn)支杆菌生(shēng)長增加;反之，實驗前用刺激中(zhōng)性粒細胞增殖的試劑，則分(fēn)枝杆菌生(shēng)長率降低。以及後來在中(zhōng)性粒細胞中(zhōng)發現了防禦素。然而，中(zhōng)性粒細胞不隻是有這種對機體(tǐ)的保護作用，還有些報道顯示由于不同宿主對結核杆菌的敏感性的不同，中(zhōng)性粒細胞的病理損傷作用會超過其保護作用。細胞免疫反應針對結核杆菌，如同其他胞内感染菌一(yī)樣，細胞介導的免疫反應比抗體(tǐ)介導的免疫反應更重要。于是通常會認爲結核杆菌存在胞内不能與抗體(tǐ)結合，因此體(tǐ)液免疫反應對結核感染的機體(tǐ)沒有保護作用。但是事實并非如此，抗體(tǐ)對于胞内菌感染的作用越來越得到研究者們的關注，以期得到有關結核免疫機制的更深入理解。在抗結核的細胞免疫反應中(zhōng)，主要參與的細胞是CD4+和CD8+T 細胞。巨噬細胞中(zhōng)結核杆菌通過MHCⅡ類分(fēn)子的抗原提呈給CD4+T 細胞，被早期細胞因子如IL-12、 IL-18 等誘導向Th1 型細胞分(fēn)化。這種CD4+T細胞能夠産生(shēng)大(dà)量的IFN-r等細胞因子，激活巨噬細胞，加速吞噬和殺滅結核杆菌。另外(wài)有研究說明CD4+T細胞還參與被感染的細胞的凋亡。抗原特異的溶細胞性CD4+T 細胞殺滅吞噬了結核杆菌的巨噬細胞，其中(zhōng)對細胞的溶解會導緻細菌的擴散，但是釋放(fàng)出的細菌又(yòu)會被機體(tǐ)中(zhōng)的其他巨噬細胞吞噬，這樣形成的一(yī)個惡性循環;隻有調節巨噬細胞和溶細胞性T 細胞活化之間平衡才能利于感染的控制。總的來說， CD4+T 細胞在機體(tǐ)抗結核感染起着重要作用，當例如HIV 感染的病人， 缺乏CD4+T 細胞時，結核感染便不能控制。對于CD8+T細胞對結核感染的控制作用主要是産生(shēng)顆粒溶素(granulysin)和穿孔素來直接殺滅結核杆菌;還有r/δT 細胞，在天然免疫和适應性免疫起連接作用，其作用不僅僅是産生(shēng)細胞因子和細胞毒性作用，還可以維持宿主細胞的完整性和内環境的穩态。另外(wài)還有些調節性T 細胞和單核細胞都能産生(shēng)免疫抑制

性的細胞因子TGF-β，可以被manLAM 刺激分(fēn)泌增加，下(xià)調調節炎症反應，利于結核杆菌的生(shēng)存。

A.7.2 免疫與超敏反應

結核分(fēn)枝杆菌所緻免疫應答的特點，是機體(tǐ)對結核分(fēn)枝杆菌産生(shēng)特異性免疫的同時，也産生(shēng)了遲發型超敏反應。随着機體(tǐ)對結核分(fēn)枝杆菌産生(shēng)保護作用的同時，也可以看到有遲發型超敏反應的産生(shēng)，二者均爲T細胞介導的結果。從郭霍現象(Koch phenomenon)可以看到，将結核分(fēn)枝杆菌初次注入健康豚鼠皮下(xià), 10 d～14 d後局部潰爛不愈，附近淋巴結腫大(dà)，細菌擴散至全身，表現爲原發感染的特點。若以結核分(fēn)枝杆菌對以前曾感染過結核的豚鼠進行再感染，則于1 d～2 d内局部迅速産生(shēng)潰爛，易愈合。

附近淋巴結不腫大(dà)，細菌亦很少擴散，表現爲原發後感染的特點。可見再感染時潰瘍淺、易愈合、不擴散，表明機體(tǐ)已有一(yī)定免疫力。但再感染時潰瘍發生(shēng)快，說明在産生(shēng)免疫的同時有超敏反應的參與。近年來研究表明結核分(fēn)枝杆菌誘導機體(tǐ)産生(shēng)免疫和超敏反應的物(wù)質不同。

A.7.3 免疫學檢測

1976年Bassau等首次用結核杆菌培養濾液,即PPD(結核菌素純蛋白(bái)衍生(shēng)物(wù))作抗原，以ELISA法檢測89例肺結核患者及48例正常人血清中(zhōng)的結核抗體(tǐ)敏感性爲57%，特異性爲98%。 由于ELISA法簡便易行快速，且無需精密儀器，在結核病血清學診斷方面應用最多應用最廣。據報告ELISA法檢測結核抗體(tǐ)的敏感性爲62.0%～94.7%，但結核分(fēn)枝杆菌L型感染者OT或PPD實驗常呈陰性。目前可以采用免疫熒光法和膠乳凝集試驗檢驗,兩者在抗體(tǐ)稀釋度很高時，仍呈陽性反應，這與非結核分(fēn)枝杆菌L型或其他細菌L型的表現明顯不同。

A.8 結核分(fēn)枝杆菌的耐藥機制

目前對于結核杆菌耐藥機制的研究很多，但主要有以下(xià)3種觀點:細胞壁結構與組成發生(shēng)變化，使細胞壁通透性改變，藥物(wù)通透性降低，産生(shēng)降解或滅活酶類，改變了藥物(wù)作用靶位;結核杆菌中(zhōng)存在活躍的藥物(wù)外(wài)排泵系統，外(wài)排泵将菌體(tǐ)内藥物(wù)泵出，使得胞内藥物(wù)濃度不能有效抑制或殺死結核杆菌，從而産生(shēng)耐藥性;結核杆菌基因組上編碼藥物(wù)靶标的基因或藥物(wù)活性有關的酶基因突變，使藥物(wù)失效從而産生(shēng)耐藥性，這是結核杆菌産生(shēng)耐藥性的主要分(fēn)子機制。

BB

附 錄 B

(規範性附錄)

分(fēn)枝杆菌細菌學檢查

B.1 痰标本的采集、運送和保存

B.1.1 痰标本的采集

采集步驟如下(xià)：

a) 即時痰爲患者就診時深呼吸後咳出的痰液，清晨痰爲清晨晨起立即用清水漱口後深咳出的痰液，夜間痰爲送痰前一(yī)日夜間咳出的痰液;合格的痰标本應是膿樣、幹酪樣或膿性黏液樣性質的痰液，痰量以 3 mL～5 mL 爲宜。

b) 痰标本應由檢驗人員(yuán)或經培訓合格的專人驗收，痰液不合格者，要求重新送檢;當難以獲得合格标本時，也應進行細菌學檢查，但應注明标本性狀，以便分(fēn)析結果時參考。

c) 留取痰标本的容器應采用國際通用螺旋蓋痰瓶，或選用直徑 40 mm、高 20 mm 有螺旋蓋可密封的塑料盒，容器上應注明患者姓名、編号、檢查項目、痰标本序号及送檢日期。

B.1.2 痰标本的運送

留取痰标本後，應将容器密封，切勿倒置，以防痰液外(wài)溢;需外(wài)送檢查的标本應認真核對痰盒上的标注是否正确清晰，是否與檢驗單一(yī)緻，痰容器應采用專用的運輸盒運送。

B.1.3 痰标本的保存

當天不能檢查的痰标本應置4℃冰箱内保存。

B.2 萋-尼氏抗酸染色顯微鏡檢查

B.2.1 檢驗目的

檢測樣本中(zhōng)有無分(fēn)枝杆菌，用于結核病的診斷。

B.2.2 方法原理

分(fēn)枝杆菌的染色鏡檢可以使用不同的染料，但均是依據分(fēn)枝杆菌細胞膜含脂質較多，其中(zhōng)主要成分(fēn)爲分(fēn)枝菌酸，菌酸具有抗酸性，染料将分(fēn)枝杆菌染色後，分(fēn)枝杆菌細胞膜能抵抗鹽酸乙醇等脫色劑作用，使分(fēn)枝杆菌能保持染料的顔色。分(fēn)枝杆菌抗酸性是菌體(tǐ)内的分(fēn)枝菌酸、 RNA蛋白(bái)及其細菌壁的完整性相結合的綜合反應， 即抗酸性的強弱除與細菌壁的完整性有關以外(wài)，還與其細菌成熟和衰老程度有關。

萋-尼氏染色法，是複紅染色液在石炭酸的協同作用下(xià)，并對标本加熱促進染色劑同被染細胞的結合，将抗酸杆菌染成紫紅色，随後使用酸性酒精脫色，抗酸杆菌能保持紫紅色，而其他脫落細胞或标本中(zhōng)的非抗酸杆菌被酸性酒精脫去(qù)顔色，後經複染劑亞甲蘭複染爲藍(lán)色，光學鏡下(xià)觀察，可在藍(lán)色背景下(xià)看到紫紅色的杆狀抗酸菌。

B.2.3 檢測樣品

B.2.3.1 痰

B.2.3.2 其他類型臨床标本

包括胸水、腹水、尿液、腦脊液、胃液、膿液(分(fēn)泌物(wù)、穿刺液等)、病理組織或幹酪塊、糞便和咽喉棉拭子、支氣管灌洗液等臨床标本。

B.2.3.3 分(fēn)枝杆菌培養物(wù)

液體(tǐ)和固體(tǐ)分(fēn)枝杆菌培養物(wù)(形态學鑒定)。

B.2.4 檢測設備儀器

生(shēng)物(wù)安全櫃、離(lí)心機、天平、高壓滅菌器、冰箱、顯微鏡、渦旋振蕩器。

B.2.5 檢測試劑材料及配制方法

材料如下(xià)：

a) 0.8%堿性複紅染液：

1) 堿性複紅乙醇儲存液： 8 g 堿性複紅溶于 95%酒精溶液 100 mL 中(zhōng)，充分(fēn)振蕩使複紅溶解，避光保存。

2) 5%石碳酸水溶液： 50℃水浴加熱溶解石碳酸， 5 g 石碳酸溶于 90 mL 蒸餾水中(zhōng)，待溶液冷卻至室溫，補充蒸餾水至 100 mL。

3) 堿性複紅染色應用液： 10 mL 堿性複紅乙醇儲存液與 90 mL 5%石碳酸水溶液混合，用定性濾紙(zhǐ)過濾。

b) 5%鹽酸乙醇脫色液：

35%濃鹽酸5 mL緩慢(màn)加入95%乙醇95 mL中(zhōng)混合。

c) 0.06%亞甲蘭複染液：

1) 亞甲蘭儲存液：0.3 g 亞甲蘭溶于 95%乙醇 50 mL 中(zhōng)，完全溶解後加蒸餾水至終體(tǐ)積 100mL;

2) 亞甲蘭複染液：以蒸餾水 5 倍稀釋 0.3%亞甲蘭儲存液，用定性濾紙(zhǐ)過濾即得亞甲蘭複染液;

d) 磨砂載玻片、竹簽、 2B 鉛筆、鏡油、染色架、玻片盒等。

B.2.6 操作步驟

B.2.6.1 塗片制備

B.2.6.1.1 直接塗片法，步驟如下(xià)：

a) 使用一(yī)端有磨砂面的無劃痕的新玻片，經 95%乙醇脫脂，幹燥、清潔後備用;

b) 用 2B 鉛筆在磨砂面上注明實驗序号及标本序号;

c) 确保玻片的編号與痰盒上的編号相同;

d) 生(shēng)物(wù)安全櫃中(zhōng)，小(xiǎo)心打開(kāi)承載痰标本的容器，防止産生(shēng)氣溶膠或使标本外(wài)溢;

e) 仔細觀察标本，使用折斷的竹簽茬端，挑取痰标本中(zhōng)幹酪樣、膿樣或可疑部分(fēn)約 0.05 mL，于玻片正面輕輕環狀均勻塗抹成 10 mm×20 mm 的卵圓形痰膜(見圖 B.1);

f) 痰膜朝上靜置在生(shēng)物(wù)安全櫃中(zhōng)， 自然幹燥後(一(yī)般約需要 30 min)進行染色鏡檢;

g) 塗抹完畢後的痰标本，在結果報告前應暫時保留。圖B.1 制備好的痰塗片示例

B.2.6.1.2 離(lí)心沉澱集菌塗片法

留取的痰标本，經高壓蒸汽(1.0 kg/cm2， 121℃ 15 min～20 min)液化和滅活處理，取出放(fàng)冷後，取5 mL～10 mL盛于容積爲50 mL的離(lí)心玻管中(zhōng)加滅菌蒸餾水20 mL～30 mL，振蕩器上振蕩5 min～10 min，在3 000 g離(lí)心15 min～30 min，使結核分(fēn)枝杆菌集中(zhōng)于試管底部，取沉澱物(wù)塗片。

B.2.6.1.3 其他類型臨床标本，步驟如下(xià)：

a) 膿液：同痰液塗片;

b) 病理組織或幹酪塊：先用組織研磨器研磨後再進行塗片;

c) 尿液：送檢标本應首先靜置 2 h～4 h，取沉澱部分(fēn)約 20 mL～50 mL， 3 000 g 離(lí)心 20 min～30 min，取沉澱塗片;

d) 胸、腹水标本：參照尿液塗片;

e) 腦脊液：無菌操作收集腦脊液， 置冰箱或室溫 24 h，待薄膜形成後進行塗片;或将腦脊液經3 000 g 離(lí)心 20 min～30 min，取沉澱塗片檢查;

f) 糞便：标本與生(shēng)理鹽水混合後，充分(fēn)振蕩使之成爲混懸液;定性濾紙(zhǐ)過濾後，濾液經 3 000 g離(lí)心 20 min～30 min， 沉澱進行塗片檢查;

g) 咽喉棉拭子：棉拭子放(fàng)入無菌試管中(zhōng)，加入适量生(shēng)理鹽水浸泡，并強烈振蕩，取出棉拭子後，液體(tǐ)在 3 000 g 離(lí)心 20 min～30 min，沉澱進行塗片檢查;

B.2.6.2 抗酸染色

步驟如下(xià)：

a) 固定：塗片自然幹燥後，放(fàng)置在染色架上，玻片間距保持 10 mm 以上的距離(lí); 加熱固定(在5 s 内将玻片經過火(huǒ)焰加熱 4 次) 。

b) 初染：滴加石碳酸複紅染液蓋滿痰膜，加熱至出現蒸氣後，停止加熱，保持染色 5 min。染色期間應始終保持痰膜被染色液覆蓋，必要時可續加染色液。加熱時勿使染色液沸騰。高海拔地區應适當增加加熱次數和染色時間。

c) 水洗：流水自玻片一(yī)端輕緩沖洗，沖去(qù)染色液，瀝去(qù)标本上剩餘的水。

d) 脫色：自痰膜上端外(wài)緣滴加脫色劑蓋滿玻片，脫色 1 min;如有必要，流水洗去(qù)脫色液後，再次脫色至痰膜無可視紅色爲止。

e) 水洗：流水自玻片一(yī)端輕緩沖洗，沖去(qù)脫色液，瀝去(qù)玻片上剩餘的水。

f) 複染：滴加亞甲藍(lán)複染液，染色 30 s。

g) 水洗：流水自玻片一(yī)端輕緩沖洗，沖去(qù)複染液，然後瀝去(qù)标本上剩餘的水。待玻片幹燥後鏡檢。

h) 效果：一(yī)張染色合格的玻片，痰膜肉眼觀爲亮藍(lán)色，無紅色斑塊。

B.2.6.3 顯微鏡檢查

步驟如下(xià)：

a) 使用 10 倍目鏡雙目顯微鏡讀片。

b) 取染色完畢且已幹燥的玻片，痰膜向上放(fàng)置在玻片台上并以卡尺固定。

c) 首先使用 40×物(wù)鏡，轉動卡尺移動玻片至痰膜左端，将光線調節至适當亮度，調節焦距至可見細胞形态。

d) 移開(kāi) 40×物(wù)鏡，在玻片上滴 1～2 滴鏡油，使用 100×油鏡進行細緻觀察，應避免油鏡鏡頭直接接觸玻片上的痰膜。

e) 讀片時，首先應從左向右觀察相鄰的視野，當玻片移動至痰膜一(yī)端時，縱向向下(xià)轉換一(yī)個視野，然後從右向左觀察，依此類推(見圖 B.2)。通常 20 mm 的痰膜，使用 100×油鏡，每橫行約有 100 個視野。

f) 在淡藍(lán)色背景下(xià)，抗酸菌呈紅色，其他細菌和細胞呈藍(lán)色。

g) 仔細觀察完 300 個視野，一(yī)般需要 5 min 以上，每個工(gōng)作日，一(yī)位鏡檢人員(yuán)的玻片閱讀量不應超過 25 張，且連續閱讀 10～12 張玻片後，應休息 20 min 左右。

B.2.7 結果判讀

萋-尼氏染色抗酸杆菌陰性：連續觀察300個不同視野，未發現抗酸杆菌;

萋-尼氏染色抗酸杆菌陽性 抗酸杆菌菌數： 1～8條/300視野;

萋-尼氏染色抗酸杆菌陽性(1+)： 3～9條/100視野，連續觀察300個視野;

萋-尼氏染色抗酸杆菌陽性(2+)： 1～9條/10視野，連續觀察100個視野;

萋-尼氏染色抗酸杆菌陽性(3+)： 1～9條/1視野;

萋-尼氏染色抗酸杆菌陽性(4+)：≥10條/1視野。

報告1+時至少觀察300個視野，報告2+至少觀察100個視野， 3+、 4+時至少觀察50個視野。

不典型抗酸菌(如：顆粒體(tǐ)、絲狀體(tǐ)、巨球體(tǐ)等)，按實際觀察情況描述報告結果。例如：萋-尼氏染色陽性顆粒體(tǐ)(2+)。

B.2.8 質量控制

塗片鏡檢的質量保證要按照《中(zhōng)國結核病防治規劃•痰塗片鏡檢标準化操作及質量保證手冊》要求的程序和頻(pín)度執行。

B.3 熒光染色顯微鏡檢查

B.3.1 檢驗目的

檢測樣本中(zhōng)分(fēn)枝杆菌，用于結核病的診斷。

B.3.2 方法原理

分(fēn)枝杆菌在金胺“O”染液染色後，在含有紫外(wài)光源的熒光顯微鏡下(xià)發出橘黃顔色，高倍鏡(物(wù)鏡40倍 目鏡10倍)下(xià)，可見分(fēn)枝杆菌産生(shēng)黃綠色熒光，呈杆狀或分(fēn)枝狀。

B.3.3 檢測樣品

同萋-尼氏抗酸染色。

B.3.4 設備儀器

熒光顯微鏡。

B.3.5 試劑材料

B.3.5.1 熒光染色液配制

材料如下(xià)：

 

a) 金胺“O”染液
金胺“O”	1 g
石碳酸	50 mL
乙醇	100 mL
補蒸餾水至	1 000 mL
b) 脫色劑	5％鹽酸乙醇（配制方法參照萋－尼氏染色） ；
c) 複染劑	0.5％高錳酸鉀水溶液。

 

B.3.5.2塗片制備

同萋-尼氏抗酸染色法。

B.3.6 操作步驟

B.3.6.1 熒光染色

步驟如下(xià)：

a) 染色：塗片經火(huǒ)焰固定後，滴加金胺“O”染色劑蓋滿玻片，染色 30 min， 流水自玻片一(yī)端輕緩沖洗，洗去(qù)染色液，瀝去(qù)玻片上剩餘的水;

b) 脫色： 痰膜上端外(wài)緣滴加脫色劑，蓋滿玻片，脫色 3 min 或至無色，流水自玻片一(yī)端輕洗，洗去(qù)脫色劑;

c) 複染：加複染劑複染 1 min，瀝去(qù)複染液，流水自玻片一(yī)端輕洗，自然幹燥後鏡檢。

B.3.6.2 顯微鏡檢查

有塗膜面向上放(fàng)置玻片于熒光或LED顯微鏡載物(wù)台，并以卡尺固定後，首先以10×目鏡、 20×物(wù)鏡進行鏡檢，發現疑爲分(fēn)枝杆菌的熒光杆狀物(wù)質，使用40×物(wù)鏡确認。在暗背景下(xià)， 分(fēn)枝杆菌發出黃色熒光，呈杆狀略彎曲。

B.3.7 結果判讀

熒光染色鏡檢結果分(fēn)級報告标準：

熒光染色分(fēn)枝杆菌陰性 (-)： 0條/50視野;

熒光染色分(fēn)枝杆菌陽性(報告分(fēn)枝杆菌數)： 1～9條/50視野;

熒光染色分(fēn)枝杆菌陽性(1+)： 10～49條/50視野;

熒光染色分(fēn)枝杆菌陽性(2+)： 1～9條/1視野;

熒光染色分(fēn)枝杆菌陽性(3+)： 10～99條/1視野;

熒光染色分(fēn)枝杆菌陽性(4+)： 100條及以上/1視野。

報告2+至少觀察50個視野， 3+及以上的陽性結果至少觀察20個視野。

B.3.8 質量控制

痰塗片應保存近期3個月，年塗片量不足500張的實驗室痰塗片應保存1年， 3月痰塗片量超過1 000張的，保存近期1 000張痰塗片，供上級結核病實驗室(或質量控制機構)進行質量控制複驗。

B.4 痰标本分(fēn)枝杆菌固體(tǐ)培養基培養檢查

B.4.1 檢驗目的

分(fēn)離(lí)臨床标本的分(fēn)枝杆菌。

B.4.2 測定方法

目測法。

B.4.3 實驗原理

分(fēn)枝杆菌因其較厚的細胞壁而具有耐受酸堿的特點，能耐受堿性消化液的處理，而酸性培養基能中(zhōng)和堿性标本處理液，堿消化液消化後标本可直接接種于酸性培養基上，用以分(fēn)枝杆菌的分(fēn)離(lí)培養。

B.4.4 标本要求

B.4.4.1 病人準備

不需要特殊準備。

B.4.4.2 标本類型

痰标本。

B.4.4.3 标本采集

具體(tǐ)步驟如下(xià)：

a) 當患者咳嗽、咳痰時，易産生(shēng)含有結核分(fēn)枝杆菌的氣溶膠，感染周邊人群的機率較高，故采集痰标本時應在遠離(lí)人群的開(kāi)放(fàng)空間，或通風良好的留痰室内進行;

b) 深吸氣2次～3次，每次用力呼出，從肺部深處咳出，将打開(kāi)蓋的痰盒靠近嘴邊收集痰液，擰緊盒蓋;

c) 如果患者剛吃過東西，應先用清水漱口， 裝有義齒的患者在留取痰标本之前應先将義齒取出;

d) 标本量： 2 mL;

e) 不可接受樣本：唾液;

f) 标本儲存與标本穩定性： 标本在2℃～8℃可保存5 d。

B.4.5 設備和試劑

B.4.5.1 設備

二級生(shēng)物(wù)安全櫃、恒溫培養箱、渦旋振蕩器。

B.4.5.2 試劑

前處理管(50 mL離(lí)心管)、無菌吸管(每份标本需要2支吸管： 1支前處理吸标本， 1支接種)、試管架、斜面培養架、培養管架、廢液缸(注意：内盛不腐蝕高壓滅菌器的消毒液)、廢棄物(wù)袋。

4%氫氧化鈉(NaOH)溶液，酸性改良羅氏培養基。

B.4.6 操作程序

B.4.6.1 準備

具體(tǐ)準備如下(xià)：

a) 将酸性改良羅氏培養基從冷藏環境中(zhōng)取出，室溫下(xià)放(fàng)置;

b) 接通生(shēng)物(wù)安全櫃電(diàn)源， 開(kāi)風機保持預熱15 min;

c) 按照标本上的信息，将患者姓名或實驗序号标記在前處理管上;

d) 待酸性改良羅氏培養基恢複至室溫，在培養管斜面的背面标記患者姓名、實驗序号、接種日期。

B.4.6.2 标本處理

具體(tǐ)步驟如下(xià)：

a) 對照标記的患者姓名，在生(shēng)物(wù)安全櫃内使用無菌吸管吸取約2 mL标本于相應标記的前處理管中(zhōng);

b) 旋緊痰标本容器螺旋蓋;

c) 視痰标本性狀， 使用吸管，将1倍～2倍痰标本體(tǐ)積的4% NaOH加入前處理管中(zhōng);

d) 旋緊處理管螺旋蓋，将前處理管置于試管架内;

e) 接通渦旋振蕩器電(diàn)源， 在生(shēng)物(wù)安全櫃内将前處理管在渦旋振蕩器上渦旋振蕩30 s左右至痰标本液化;

f) 如果以手持拿前處理管，持拿方法是以拇指、無名指分(fēn)别持拿處理管外(wài)壁，食指、中(zhōng)指按處理管螺旋蓋;

g) 将前處理管置于試管架内，置于生(shēng)物(wù)安全櫃内，室溫靜置15 min。

B.4.6.3 接種

具體(tǐ)步驟如下(xià)：

a) 擰開(kāi)酸性改良羅氏培養管螺旋蓋，檢查培養基斜面底部的冷凝水，如果冷凝水過多，則沿着斜面相對的一(yī)面的培養管内壁，将冷凝水棄去(qù);

b) 以無菌吸管吸取前處理後的痰标本，吸取接近結束時，将吸管口移出液面，使吸管前端一(yī)段不含液體(tǐ)，避免液體(tǐ)意外(wài)滴落;

c) 保持培養基斜面水平或底端略低，均勻接種至酸性改良羅氏培養基斜面上，每支培養基使用接種2滴(0.1 mL～0.15 mL)，接種時第一(yī)滴液體(tǐ)接種至斜面中(zhōng)部，第二滴接種到培養基上部;

d) 将用過的吸管置于生(shēng)物(wù)安全櫃内的廢液缸内;

e) 旋上培養管螺旋蓋，不要太緊;

f) 輕輕轉動并放(fàng)低培養管底部，使接種的液體(tǐ)均勻的在斜面上鋪開(kāi);

g) 将培養基放(fàng)置在斜面培養架上，保持培養基斜面水平向上;

h) 重複步驟a)～g)，直至全部培養基接種完畢。

B.4.6.4 觀察報告

具體(tǐ)步驟如下(xià)：

a) 将接種後的培養基連同斜面培養架置于恒溫培養箱内， 36℃±1℃孵育;

b) 24 h後，再擰緊培養管螺旋蓋，放(fàng)置于直立的培養管架上， 36℃±1℃條件下(xià)繼續孵育;

c) 接種後第3天和第7天觀察培養情況，此後每周觀察一(yī)次，直至第8周末。每次觀察後要在培養結果記錄本上記錄觀察結果。

B.4.7 結果判讀

結核杆菌的典型菌落形态爲：不透明淡黃色、粗糙、幹燥、凸起于培養基、有的成菜花樣。如果發現培養基液化、或者長黴菌，則報告污染。

分(fēn)枝杆菌分(fēn)級報告标準：

無菌落生(shēng)長 報告培養陰性

菌落生(shēng)長不及斜面面積1/4時， 報告實際菌落數

菌落占斜面面積 1/4 報告(1+)

菌落占斜面面積1/2 報告(2+)

菌落占斜面面積3/4 報告(3+)

菌落布滿培養基斜面 報告(4+)

B.4.8 質量控制

參照《分(fēn)枝杆菌分(fēn)離(lí)培養标準化操作程序及質量保證手冊》進行質量控制。

CC

附 錄 C

(規範性附錄)

結核病病理學檢查

C.1 結核病病理學特征

病理學改變表現爲上皮細胞樣肉芽腫性炎，光學顯微鏡下(xià)可見大(dà)小(xiǎo)不等和數量不同的壞死性和非壞死性的肉芽腫。肉芽腫是由上皮樣細胞結節融合而成。典型的結核病變由融合的上皮樣細胞結節組成，中(zhōng)心爲幹酪樣壞死，周邊可見郎罕多核巨細胞，外(wài)層爲淋巴細胞浸潤和增生(shēng)的纖維結締組織。證明結核性病變，需要在病變區找到病原菌。組織病理學通常可采用抗酸染色方法。切片染色後顯微鏡下(xià)常常可以在壞死區中(zhōng)心或壞死區與上皮樣肉芽腫交界處查見紅染的兩端鈍圓并稍彎曲的短棒狀杆菌;用金胺羅達明熒光染色，在熒光顯微鏡下(xià)也可查見杆菌。利用多聚酶鏈反應(PCR)技術能對石蠟包埋組織中(zhōng)結核杆菌DNA進行檢測并與其他抗酸杆菌相鑒别。對一(yī)些陳舊(jiù)性結核病變，僅有凝固性壞死和纖維化病變，在抗酸染色未找到結核杆菌情況下(xià)，應用PCR對結核杆菌DNA檢測，敏感性和特異性高，對于确定診斷有較好幫助。

C.2 臨床病理學診斷

C.2.1 穿刺物(wù)塗片檢查

穿刺物(wù)塗片檢查是利用細針穿刺，吸取病變部位的少量體(tǐ)液及細胞标本，通過對穿刺物(wù)塗片行萋-尼(Ziehl-Neelsen)氏抗酸染色法染色、鏡檢查找抗酸陽性杆菌,方法簡便易行，結果較爲可靠，廣泛應用于臨床。

C.2.2 活檢組織病理學診斷

結核分(fēn)枝杆菌引起慢(màn)性感染屬于特殊性炎症，可引起細胞免疫反應和IV型變态反應，具備一(yī)般炎症的滲出、壞死和增生(shēng)3種基本變化，亦有其特殊性，詳見如下(xià)：

a) 滲出性病變：主要表現爲漿液性或漿液纖維素性炎。病變早期局部有中(zhōng)性粒細胞浸潤，但很快被巨噬細胞所取代，在滲出液和巨噬細胞中(zhōng)可查見結核杆菌。

b) 增生(shēng)性病變：形成具有診斷價值的結核結節，由上皮樣細胞、郎罕多核巨細胞以及外(wài)周聚集的淋巴細胞和少量增生(shēng)的纖維母細胞構成，典型者結節中(zhōng)央有幹酪樣壞死。

c) 變質性病變：上述以滲出爲主或以增生(shēng)爲主的病變均可繼發幹酪樣壞死，結核壞死竈由于含脂質較多呈淡黃色、均質細膩，質地較實，狀似奶酪，故稱幹酪樣壞死。幹酪樣壞死對結核病病理診斷具有一(yī)定的意義。顯微鏡下(xià)爲紅染無結構的顆粒狀物(wù)，幹酪樣壞死物(wù)中(zhōng)常見少數結核杆菌。滲出、壞死和增生(shēng) 3 種變化往往同時存在而以某一(yī)種改變爲主，而且可以互相轉化。

典型結核(結核結節)的病理診斷較容易，而不具備典型結核病理變化的病例則常需借助抗酸染色找到結核杆菌從而明确診斷。多數結核病竈特别是幹酪樣壞死組織中(zhōng)及其周圍組織内可查到結核杆菌。還可采用現代分(fēn)子生(shēng)物(wù)學檢測手段，如聚合酶鏈反應(PCR法)、原位雜(zá)交和基因測序等作輔助診斷。

盡管如此，仍有少數病例可能因組織取材以及處理不當等因素不能明确診斷，還需參考臨床表現、結核菌素試驗、影像學及診斷性治療等才能明确診斷。

DD

附 錄 D

(規範性附錄)

結核菌素皮膚試驗

D.1 結核菌素皮膚試驗方法

在左前臂掌側前1/3中(zhōng)央皮内注射5 IU PPD，以局部出現7 mm～8 mm大(dà)小(xiǎo)的圓形橘皮樣皮丘爲宜。

D.2 查驗反應

72 h(48 h～96 h)檢查反應。以皮膚硬結爲準。

陰性(-)：硬結平均直徑<5 mm或無反應者爲陰性。

陽性反應(+)：硬結平均直徑≥5 mm者爲陽性。 硬結平均直徑≥5 mm， <10 mm爲一(yī)般陽性; 硬結平均直徑≥10 mm， <15 mm爲中(zhōng)度陽性; 硬結平均直徑≥15 mm或局部出現雙圈、 水泡、壞死及淋巴管炎者爲強陽性。

D.3 結核菌素皮膚試驗的假陰性反應

結核菌素皮膚試驗假陰性反應如下(xià)：

a) 變态反應前期：從結核分(fēn)枝杆菌感染到産生(shēng)反應約需一(yī)個多月，在反應前期，結核菌素試驗無反應;

b) 免疫系統受幹擾：急性傳染病，如百日咳、麻疹、白(bái)喉等，可使原有反應暫時受到抑制，呈陰性反應;

c) 免疫功能低下(xià)：重症結核病、腫瘤、結節病、艾滋病等結素反應可降低或無反應， 但随着病情好轉，結核菌素試驗可又(yòu)呈陽性反應;

d) 結核菌素試劑失效或試驗方法錯誤，也可出現結核菌素試驗陰性。

D.4 結核感染判斷标準

判讀結核感染标準如下(xià)：

a) 一(yī)般情況下(xià)，在沒有卡介苗接種和非結核分(fēn)枝杆菌幹擾時， PPD反應硬結≥5 mm應視爲已受結核菌感染;

b) 在卡介苗接種地區和或非結核分(fēn)枝杆菌感染流行地區，以PPD反應≥10 mm爲結核感染标準;

c) 在卡介苗接種地區和或非結核分(fēn)枝杆菌流行地區，對HIV陽性、接受免疫抑制劑>1個月， PPD反應≥5 mm爲結核感染;

d) 與塗片陽性肺結核有密切接觸的5歲以下(xià)兒童， PPD反應≥5 mm爲結核感染;

e) PPD反應≥15 mm及以上或存在水泡、 壞死、 淋巴管炎等爲結核感染強反應。

EE

附 錄 E

(資(zī)料性附錄)

肺結核鑒别診斷、非結核分(fēn)枝杆菌肺病

E.1 肺結核鑒别診斷

E.1.1 影像呈浸潤表現的肺結核鑒别

影像呈浸潤表現的肺結核應與細菌性肺炎、肺真菌病和肺寄生(shēng)蟲病等感染性肺疾病相鑒别。細菌性肺炎常有受涼史，多伴血白(bái)細胞升高，抗感染治療病竈吸收較快;肺真菌病常有長期應用抗生(shēng)素、免疫抑制劑或患有免疫疾病史，痰真菌培養陽性，血G試驗及GM試驗陽性，抗炎、抗結核治療無效，抗真菌治療有效;肺寄生(shēng)蟲病患者常有在流行地區居住史，食污染食物(wù)及飲生(shēng)水史，痰内或胸水查到蟲卵，血清特異性抗體(tǐ)檢查有助于診斷。

E.1.2 肺結核球鑒别

肺結核球與周圍性肺癌、炎性假瘤、肺錯構瘤和肺隔離(lí)症等相鑒别。周圍性肺癌患者常以咳嗽、胸痛就診或體(tǐ)檢發現病竈，病竈多有分(fēn)葉、毛刺，多無衛星病竈，患者痰中(zhōng)可找到瘤細胞，經皮肺穿刺活檢或經支氣管鏡肺活檢病理檢查常能确診;炎性假瘤是一(yī)種病因不明炎性肉芽腫病變，患者以前曾有慢(màn)性肺部感染史，抗炎治療病竈逐漸縮小(xiǎo);肺錯構瘤常爲孤立病竈，呈爆米花樣陰影;肺隔離(lí)症以20歲年輕人較多，不伴肺内感染時可長期無症狀，病變好發于肺下(xià)葉後基底段，以左下(xià)肺多見，密度均勻、邊緣清楚，很少鈣化，血管造影及肺放(fàng)射性核素掃描可見單獨血供，可确診。

E.1.3 血行播散性肺結核鑒别

血行播散性肺結核與支氣管肺泡細胞癌、肺含鐵血黃素沉着症和彌漫性肺間質病相鑒别。肺泡細胞癌患者多無結核中(zhōng)毒症狀，胸悶、氣短症狀明顯，可以有較多泡沫樣痰液，病竈多發生(shēng)于雙肺中(zhōng)下(xià)肺野，分(fēn)布不均勻，痰中(zhōng)檢查可查到癌細胞，經皮肺活檢、經支氣管鏡肺活檢常能确診;肺含鐵血黃素沉着症患者常有反複咳嗽、咯血及缺鐵性貧血症狀，有過敏、二尖瓣狹窄、肺出血-腎炎綜合征等病史，陰影中(zhōng)下(xià)肺野分(fēn)布較多，患者痰巨噬細胞内發現含鐵血黃素顆粒可助診斷，确診通常依靠經皮肺組織活檢或經支氣管鏡肺活檢病理檢查;彌漫性肺間質病患者病史較長，進行性呼吸困難，部分(fēn)患者有粉塵接觸史，陰影以中(zhōng)下(xià)肺野、内中(zhōng)帶較多，患者未并發感染時，多無發熱，低氧血症明顯，确診通常需肺活檢病理檢查。

E.1.4 支氣管淋巴結結核鑒别

支氣管淋巴結結核與中(zhōng)央型肺癌、淋巴瘤和結節病相鑒别。肺癌患者年齡多在40歲以上，患者早期可有刺激性幹咳、血痰，多無結核中(zhōng)毒症狀;淋巴瘤爲淋巴系統的惡性腫瘤，可表現單側或雙側肺門淋巴結腫大(dà)，患者多伴血色素降低、淺表部位淋巴結腫大(dà);結節病是原因不明的全身性肉芽腫疾病，影像學表現雙側肺門或縱隔淋巴結腫大(dà)，結核菌素試驗多爲陰性， Kveim試驗陽性，血管緊張素轉化酶升高，腎上腺皮質激素治療有效，以上疾病确診通常需支氣管鏡檢查或超聲内鏡檢查并病理檢查。

E.1.5 肺結核空洞鑒别

肺結核空洞與癌性空洞、肺囊腫和囊性支氣管擴張相鑒别。肺癌性空洞洞壁多不規則，空洞内可見結節狀突起，空洞周圍無衛星竈，空洞增大(dà)速度較快;肺囊腫爲肺組織先天性異常，多發生(shēng)在肺上野，并發感染時，空腔内可見液平，周圍無衛星竈，未并發感染時可多年無症狀，病竈多年無變化;囊性支氣管擴張多發生(shēng)在雙肺中(zhōng)下(xià)肺野，患者常有咳大(dà)量膿痰、咯血病史，薄層CT掃描或碘油支氣管造影可助診斷。

E.1.6 結核性胸膜炎鑒别

結核性胸膜炎與各種漏出性胸腔積液、癌性胸腔積液和肺炎旁胸腔積液相鑒别。胸腔積液診斷的一(yī)項必要工(gōng)作是鑒别是滲出液(來自侵及胸膜的疾病或導緻血管通透性增加和或胸腔淋巴回流減少的疾病)還是漏出液(起因與正常胸膜系統胸内流體(tǐ)靜力壓和膠體(tǐ)滲透壓的紊亂)，其鑒别目前仍采用Light标準檢測胸液(PF)、血清乳酸脫氫酶(LDH)和總蛋白(bái)。如果符合下(xià)列一(yī)項或多項标準，胸液可能是滲出性的：

a) PF的蛋白(bái)/血清蛋白(bái)比值>0.5;

b) PF的LDH/血清LDH比值>0.6;

c) PF的LDH>2/3正常血清LDH上限。

胸腔積液脂質和膽固醇的測量一(yī)般用于懷疑乳糜胸或假性乳糜胸的診斷。當胸腔積液總甘油三酯(TG)>110 mg/dL，胸腔積液TG/血清TG>1，胸腔積液膽固醇/血清膽固醇<1時，可診斷乳糜胸。胸腔積液TG<50 mg/dL可排除乳糜胸的診斷。心源性胸腔積液、肝性胸腔積液和腎性胸腔積液，臨床上積液多爲雙側，有原發病病史，無結核中(zhōng)毒症狀，胸水密度1.016，蛋白(bái)含量<30 g/L，通常爲漏出液，原發病好轉後胸水很快吸收。腫瘤胸膜轉移及胸膜間皮瘤，患者常有劇痛，胸水多爲血性，胸水瘤細胞及胸膜活檢特别是胸腔鏡下(xià)直視活檢病理檢查可助診斷。肺炎旁胸腔積液患者有感染史，抗感染治療後胸水很快吸收。

E.1.7 肺結核與非結核分(fēn)枝杆菌肺病鑒别

非結核分(fēn)枝杆菌肺病臨床表現酷似肺結核病。多繼發于支氣管擴張、矽肺和肺結核病等慢(màn)性肺病，也是人類免疫缺陷病毒(HIV)感染或獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的常見并發症。常見臨床症狀有咳嗽、咳痰、咯血、發熱等。胸片可表現爲炎性病竈及單發或多發薄壁空洞，纖維硬結竈、球形病變及胸膜滲出相對少見。病變多累及上葉的尖段和前段。但亦約有20%～50%的病人無明顯症狀。痰抗酸染色塗片檢查陽性，無法區别結核分(fēn)枝杆菌與非結核分(fēn)枝杆菌，隻有通過分(fēn)枝杆菌培養菌型鑒别方可鑒别。

其病理組織學基本改變類似于結核病，但非結核分(fēn)枝杆菌肺病的組織學上改變以類上皮細胞肉芽腫改變多見，無明顯幹酪樣壞死。膠原纖維增生(shēng)且多呈現玻璃樣變，這是與結核病的組織學改變區别的主要特點。目前尚無特效治療非結核分(fēn)枝杆菌肺病的化學藥物(wù)和标準的化療方案，且多數非結核分(fēn)枝杆菌對抗結核藥物(wù)耐藥，故主張抗結核藥物(wù)與其他抗生(shēng)素聯合使用，方案中(zhōng)藥物(wù)以3種～5種爲宜，一(yī)般情況下(xià)，非結核分(fēn)枝杆菌肺病在抗酸杆菌陰轉後仍需繼續治療18個月～24個月，至少12個月，與肺結核化療方案明顯不同。

E.2 非結核分(fēn)枝杆菌肺病

E.2.1 非結核分(fēn)枝杆菌(NTM) 定義

NTM指除結核分(fēn)枝杆菌複合群和麻風分(fēn)枝杆菌以外(wài)的其他分(fēn)枝杆菌總稱。 NTM感染指感染了NTM，但未發病; NTM病指感染了NTM，并引起相關組織、髒器的病變。

E.2.2 NTM分(fēn)離(lí)培養和菌種鑒定方法

NTM分(fēn)離(lí)培養和菌種鑒定方法包括以下(xià)幾種：

a) 傳統方法：包括液體(tǐ)和固體(tǐ)培養基培養;

b) 高效液相色譜法;

c) 分(fēn)子生(shēng)物(wù)學方法。

E.2.3 NTM肺病的臨床表現

NTM病的全身中(zhōng)毒症狀和局部損害表現與結核病相似，在無菌種鑒定結果的情況下(xià)，可長期被誤診爲結核病。女性患病率明顯高于男性，老年人居多。大(dà)多數患者肺部已有基礎疾病，如COPD、支氣管擴張症、囊性纖維化、塵肺病、肺結核和肺泡蛋白(bái)沉着症等。患者的臨床表現差别較大(dà)，有的人沒有明顯症狀，由體(tǐ)檢發現;有的人已進展到肺空洞，病情嚴重;多數人發病緩慢(màn)，常表現爲慢(màn)性肺部疾病的惡化，也可有急性發病;可有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、氣急、盜汗、低熱、乏力、消瘦和萎靡不振等症狀。

X線胸片顯示炎性病竈及單發或多發的薄壁空洞，而纖維硬結竈、球形病變及胸膜滲出相對少見。

病變多累及上葉尖段和前段。胸部CT，尤其是高分(fēn)辨CT可清楚顯示NTM肺病的肺部病竈，可有結節影、斑片及小(xiǎo)斑片樣實變影、空洞(尤其是薄壁空洞)影、支氣管擴張、樹(shù)芽征、磨玻璃影、線狀及纖維條索影、胸膜肥厚粘連等表現，且通常以多種形态病變混雜(zá)存在。由于NTM病程較長、肺組織破壞較重及并發症的存在，一(yī)般NTM肺病患者的肺通氣功能減退較肺結核更爲明顯。

E.2.4 NTM肺病的診斷

E.2.4.1 NTM感染

NTM皮膚試驗陽性以及缺乏組織、器官受到NTM侵犯的依據，符合上述條件者即可診斷爲NTM感染。

E.2.4.2 疑似NTM病

符合以下(xià)條件之一(yī)即可考慮爲疑似NTM病：

a) 痰抗酸杆菌檢查陽性而臨床表現與肺結核不相符者;

b) 痰液顯微鏡檢查發現菌體(tǐ)異常的分(fēn)枝杆菌;

c) 痰或其他标本中(zhōng)分(fēn)枝杆菌培養陽性，但其菌落形态和生(shēng)長情況與MTB複合群有異;

d) 接受正規抗結核治療無效而反複排菌的患者，且肺部病竈以支氣管擴張、多發性小(xiǎo)結節及薄壁空洞爲主;

e) 經支氣管衛生(shēng)淨化處理後痰分(fēn)枝杆菌不能陰轉者;

f) 有免疫功能缺陷，但已除外(wài)肺結核的肺病患者;

g) 醫源性或非醫源性軟組織損傷，或外(wài)科術後傷口長期不愈而找不到原因者。

E.2.4.3 NTM肺病

具有呼吸系統症狀和(或)全身症狀，經胸部影像學檢查發現有空洞性陰影、多竈性支氣管擴張及多發性小(xiǎo)結節病變等，已排除其他疾病，在确保标本無外(wài)源性污染的前提下(xià)，符合以下(xià)條件之一(yī)者可做出NTM肺病的診斷：

a) 痰NTM培養2次均爲同一(yī)緻病菌;

b) 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中(zhōng)NTM培養陽性1次，陽性度爲++以上;

c) BALF中(zhōng)NTM培養陽性1次，抗酸杆菌塗片陽性度爲++以上;

d) 經支氣管鏡或其他途徑的肺活組織檢查，發現分(fēn)枝杆菌病的組織病理學特征性改變(肉芽腫性炎症或抗酸染色陽性)，并且NTM培養陽性;

e) 肺活組織檢查發現分(fēn)枝杆菌病的組織病理學特征性改變(肉芽腫性炎症或抗酸染色陽性)，并且痰标本和(或)BALFNTM培養陽性≥1次。

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